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                    上海遠慕生物科技有限公司

                    如何對pcr擴增電泳條帶分析
                    點擊次數:53 發布時間:2022-03-10

                     

                     

                      PCR擴增后一般進行瓊脂糖凝膠電泳分析,電泳后一般有以下幾種條帶:

                      1、引物帶。引物濃度過高或是擴增效率不是特別高時都會有,一般不呈現為細帶,為發散狀;如果目的擴增產物帶和引物帶都很亮,可以考慮適當降低引物量。

                      2、引物二聚體帶。比引物跑得慢一點,條帶清晰,但如果擴增產物小于100bp時,產物與引物二聚體就不好分別了,建議采用DNA聚丙烯/酰胺電泳(不是蛋白質的SDS聚丙烯/酰胺電泳);如果引物二聚體在優化復性溫度后仍然嚴重影響目的產物的擴增,優先考慮更換引物設計(因為引物合成的成本比反復優化條件的成本低)

                      3、目的擴增產物帶。其大小與設計大小相同,條帶清晰。

                      4、非特異擴增產物帶。其大小與設計大小不相同,條帶清晰。一般考慮通過提高復性溫度來減少或消除(也可用溫度梯度功能來尋找最佳的復性溫度,東勝龍811型PCR儀就有此功能)。如果其片段大小比目的片段大較多,可以通過減少延伸時間來減少或消除(即不給它足夠的延伸時間)。還有一種非特異擴增產物帶是來自于逆轉錄PCR實驗時的基因組DNA的污染,如果目的擴增產物中有內含子,擴增產物很可能大于目的基因。這種條帶通過優化復性溫度是不能消除的,可以在逆轉錄前用無RNA酶的DNA酶進行樣本處理。

                      5、模板DNA帶。模板濃度過高時可能出現。如果是基因組DNA為模板,條帶可能會很亂且較大。一般進行PCR擴增時,模板濃度都不要太大,否則會產生一些比目的基因長一點的雜質DNA(可能不成條帶,也看不到),這是由PCR擴增原理造成的。

                      那么我們該如何判斷是否擴增成功呢?

                      首先要點Marker的,對照Marker的條帶,看你擴增出的條帶的大小,是否跟你預計的條帶大小一致,以此來判斷你的PCR反應是否成功。

                     

                     

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