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                    上海遠慕生物科技有限公司

                    核酸濃度測定的五種方法分享
                    點擊次數:25 發布時間:2022-03-04

                    1、定磷法

                    核糖核酸(RNA)含磷量約為9.5%,脫氧核糖核酸(DNA)含磷量約為9.2%,采用定磷法可準確測出磷含量,進而折算出樣品中核酸含量。

                    原理:在酸性條件下,定磷試劑中的鉬酸銨以鉬酸形式與樣品中的磷酸反應生成磷鉬酸,當還原劑存在時磷鉬酸立即轉變為藍色的還原產物——鉬藍;鉬藍最大的剛吸收在650-660nm波長處,根據吸光值制作標準曲線,從而確定核酸的濃度。測定范圍在1-10μg

                    優缺點:簡單、快速;但易受蛋白與核苷酸的影響。

                    2、 定糖法

                    原理:核糖中的戊糖可在濃鹽酸或者濃硫酸作用下脫水生成醛類化合物可與某些成色劑縮合成有色化合物,可用比色法或者分光光度法測定其溶液中的吸收值,在一定的濃度范圍內,溶液的吸收值與核酸的含量成正比。

                    RNA濃度的測試:RNA與濃鹽酸共熱時發生降解,產生的核糖又可轉變為糠醛,在FeCl3或CuCl2催化下,糠醛與3,5-二羥基甲苯(苔黑酚)反應形成綠色復合物,生成的綠色化合物在670nm處有最大的吸收值。測定范圍在20~250μg

                    DNA濃度的測定:脫氧核糖核酸中的脫氧核糖在酸性環境中變成戊醛與二苯胺試劑一起加熱產生藍色化合物,生成的藍色的化合物在595nm處有最大吸收值。測定范圍在20~250 μg

                    優缺點:較靈敏,但特異性較差

                    3、 紫外吸收法(分光光度法、Nanodrop)

                    組成核酸分子的堿基,由于含有芳香環結構,具有紫外吸收的特性。吸收值在波長250-270nm之間,最大吸收波長是260nm。一般1μg/ml

                    RNA溶液在1cm光徑比色皿中的光吸收峰值約為0.022,1μg/ml

                    DNA溶液的光吸收值為0.020。因此測定未知濃度RNA或DNA溶液在260nm的光吸收值即可計算出其中核酸的含量。

                    4、 熒光光度法

                    專門配套的熒光檢測技術,只有與DNA、RNA或蛋白質結合后才發出熒光的染料。這些熒光染料只有與特異性的靶分子結合時才能發出熒光信號,采用熒光染料檢測特定目標分子的濃度,可以對DNA和RNA進行精準定量。

                    優缺點:靈敏,簡便;價格昂貴

                    5、 qPCR法

                    使用熒光定量方法中的絕對定量,配套標準品,制作對應的標準曲線,使用熒光定量儀,計算對應的熒光值并轉換對應的核酸濃度。

                    優缺點:靈敏度高,誤差??;操作時間長

                     

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