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                    上海遠慕生物科技有限公司

                    核酸分離與純化的原則、操作步驟
                    點擊次數:30 發布時間:2022-03-04

                     

                     

                    磁珠提核酸
                    磁珠法純化DNA主要是利用利息交換吸附材料吸附核酸,從而將核酸和蛋白質等其細胞中其他物質分離。本文主要概述了核酸分離與純化的原則、核酸分離與純化的步驟、磁珠法純化DNA原理。

                     

                    核酸分離與純化的原則
                    核酸在細胞中總是與各種蛋白質結合在一起的。核酸的分離主要是指將核酸與蛋白質、多糖、脂肪等生物大分子物質分開。
                    在分離核酸時應遵循以下原則:保證核酸分子一級結構的完整性;排除其他分子污染。

                     

                    核酸分離與純化的步驟
                    大多數核酸分離與純化的方法一般都包括了細胞裂解、酶處理、核酸與其他生物大分子物質分離、核酸純化等幾個主要步驟。每一步驟又可由多種不同的方法單獨或聯合實現。

                     

                    1. 細胞裂解:核酸必須從細胞或其他生物物質中釋放出來。細胞裂解可通過機械作用、化學作用、酶作用等方法實現。
                      (1)機械作用:包括低滲裂解、超聲裂解、微波裂解、凍融裂解和顆粒破碎等物理裂解方法。這些方法用機械力使細胞破碎,但機械力也可引起核酸鏈的斷裂,因而不適用于高分子量長鏈核酸的分離。

                    2.  

                    (2)化學作用:在一定pH環境和變性條件下,細胞破裂,蛋白質變性沉淀,核酸被釋放到水相。上述變性條件可通過加熱、加入表面活性劑(SDS、Triton X-100等) 或強離子劑(異硫氰酸胍、鹽酸胍、肌酸胍) 而獲得。而pH環境則由加入的強堿(NaOH)或緩沖液 (TE、STE等) 提供。在一定的pH環境下,表面活性劑或強離子劑可使細胞裂解、蛋白質和多糖沉淀,緩沖液中的一些金屬離子螯合劑(EDTA等)可螯合維持核酸酶活性所必須的金屬離子Mg2+、Ca2+,從而抑制核酸酶的活性,保護核酸不被降解。

                     

                    (3)酶作用:主要是通過加入溶菌/酶或蛋白酶(蛋白酶K、植物蛋白酶或鏈酶蛋白酶)以使細胞破裂,核酸釋放。蛋白酶還能降解與核酸結合的蛋白質,促進核酸的分離。其中溶菌/酶能催化細菌細胞壁的蛋白多糖N-乙酰葡糖胺和N-乙酰胞壁酸殘基間的β-(1 ,4) 鍵水解。蛋白酶K能催化水解多種多肽鍵,其在65℃及有EDTA、尿素(1~4mol/L) 和去污劑(0.5%SDS或 1%Triton X-100)存在時仍保留酶活性,這有利于提高對高分子量核酸的提取效率。在實際工作中,酶作用、機械作用、化學作用經常聯合使用。具體選擇哪種或哪幾種方法可根據細胞類型、待分離的核酸類型及后續實驗目的來確定。

                     

                    2.酶處理:在核酸提取過程中,可通過加入適當的酶使不需要的物質降解,以利于核酸的分離與純化。如在裂解液中加入蛋白酶(蛋白酶K或鏈酶蛋白酶) 可以降解蛋白質,滅活核酸酶(DNase和RNase),DNase和RNase也用于去除不需要的核酸。

                     

                    3.核酸的分離與純化:核酸的高電荷磷酸骨架使其比蛋白質、多糖、脂肪等其他生物大分子物質更具親水性,根據它們理化性質的差異,用選擇性沉淀、層析、密度梯度離心等方法可將核酸分離、純化。

                     

                    (1)酚提取/沉淀法:核酸分離的一個經典方法是酚∶lv仿抽提法。細胞裂解后離心分離含核酸的水相,加入等體積的酚∶lv仿∶異/戊醇(25∶24∶1體積) 混合液。依據應用目的,兩相經漩渦振蕩混勻(適用于分離小分子量核酸)或簡單顛倒混勻(適用于分離高分子量核酸)后離心分離。疏水性的蛋白質被分配至有機相,核酸則被留于上層水相。酚是一種有機溶劑,預先要用STE緩沖液飽和,因未飽和的酚會吸收水相而帶走一部分核酸。酚也易氧化發黃,而氧化的酚可引起核酸鏈中磷酸二酯鍵斷裂或使核酸鏈交聯:故在制備酚飽和液時要加入82羥基喹嚀,以防止酚氧化。lv仿可去除脂肪,使更多蛋白質變性,從而提高提取效率。異/戊醇則可減少操作過程中產生的氣泡。核酸鹽可被一些有機溶劑沉淀,通過沉淀可濃縮核酸,改變核酸溶解緩沖液的種類以及去除某些雜質分子。典型的例子是在酚、lv仿抽提后用乙醇沉淀,在含核酸的水相中加入pH5.0~5.5,終濃度為0.3M的NaOAc或KOAc后,鈉離子會中和核酸磷酸骨架上的負電荷,在酸性環境中促進核酸的疏水復性。然后加入2~2.5倍體積的乙醇,經一定時間的孵育,可使核酸有效地沉淀。其他的一些有機溶劑(異丙醇、聚乙二醇(等)和鹽類(10.0mol/L醋酸銨、8.0mol/L的氯化鋰、氯化鎂和低濃度的氯/化鋅等)。不同的離子對一些酶有抑制作用或可影響核酸的沉淀和溶解,在實際使用時應予以選擇。經離心收集,核酸沉淀用70%的乙醇漂洗以除去多余的鹽分,即可獲得純化的核酸。

                     

                    (2)層析法:層析法是利用不同物質某些理化性質的差異而建立的分離分析方法。包括吸附層析、親和層析、離子交換層析等方法在內的層析法。因分離和純化同步進行,并且有商品試劑盒供應,而被廣泛應用于核酸的純化。在一定的離子環境下,核酸可被選擇性地吸附到硅土、硅膠或玻璃表面而與其他生物分子分離。另外一些選擇性吸附方法以經修飾或包被的磁珠作為固相載體,磁珠可通過磁場分離而無需離心,結合至固相載體的核酸可用低鹽緩沖液或水洗脫。該法分離純化核酸,具有質量好、產量高、成本低、快速、簡便、節省人力以及易于實現自動化等優點。

                     

                    (3)吸附法:玻璃粉或玻璃珠被證實為一種有效的核酸吸附劑。在高鹽溶液中,核酸可被吸附至玻璃基質上,離液鹽碘/化鈉或高氯/酸鈉可促進DNA與玻璃基質的結合。在該方法中,細胞在堿性環境下裂解,裂解液用醋/酸鉀緩沖液中和后,直接加至含異丙醇的玻璃珠濾板,被異丙醇沉淀的質粒DNA結合至玻璃珠,用80%乙醇真空抽洗除去細胞殘片和蛋白質沉淀。最后用含RNase的TE緩沖液洗脫與玻璃珠結合的DNA,獲得的DNA可直接用于測序。

                     

                    磁珠法純化DNA原理
                    磁珠法核酸純化技術采用了納米級磁珠微珠,這種磁珠微珠的表面標記了一種官能團,能同核酸發生吸附反應。
                    硅磁(Magnetic Silica Particle)就是指磁珠微珠表面包裹一層硅材料,來吸附核酸,其純化原理類型于玻璃奶的純化方式。
                    離心磁珠是指磁珠微珠表面包裹了一層可發生離心交換的材料(如DEAE,COOH)等,從而達到吸附核酸目的。不同性質的磁珠微珠所對應的純化原理是不一致。使用磁珠法來純化核酸的最da優點就是自動化。磁珠在磁場條件下可以發生聚集或分散,從而可徹底擺脫離心等所需的手工操作流程。


                    使用羧化磁珠同樣可以分離純化質粒DNA。該法在細胞裂解后,離心分離含質粒的水相,再加入羧化的磁粒,然后用PEG/NaCl沉淀,使目的DNA吸附至磁珠,最后磁場分離被吸附的DNA,經乙醇洗滌,用TE洗脫,可獲得高產量的適用于毛細管測序的模板DNA

                     

                     

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